Palatal Mesenkimal Hücrelerde Proliferasyonu Artıran ve Apoptozu Baskılayan miR-124-3p: Yeni Bir Bulgular Arayışı

Özet

Damaksaplık ve damak çatlağı (DSC) yaygın görülen kongenital kraniofasial anomalilerdir, ancak damak rafı büyümesini düzenleyen transkripsiyondan sonra gerçekleşen mekanizmalar tam olarak anlaşılmamıştır. Bu çalışmada, fare damak rafı gelişimi sırasında miRNA ifadesini karakterize etmek amacıyla küçük RNA sekanslaması kullanıldı ve fonksiyonel değerlendirme için miR-124-3p seçildi. In situ hibridizasyonu, miR-124-3p’nin embriyonik aşamaların çeşitlerinde damak dokularında bulunduğunu gösterdi. Kültüre edilmiş embriyonik damak mezankimal (EPM) hücreler, miR-124-3p taklidi veya inhibitörü ile transfe edildikten sonra RT-qPCR, CCK-8, EdU, Hoechst boyama ve akış sitometrisi yöntemleriyle değerlendirildi. miR-124-3p seviyelerinin artırılması, EPM hücre proliferasyon aktivitesinin ölçümlerini artırdı ve apoptozu azaltırken, miR-124-3p inhibisyonu tersine etki gösterdi. Sekanslama ve hedef tahmin analizleri keşfediciydi ve doğrudan aşağıstream bir hedefi ortaya koymadı. Bu in vitro bulgular, miR-124-3p’yi damak mezankimal hücre davranışının aday düzenleyicisi olarak tanımlar. Rolünün damak oluşumu sırasında belirlenmesi için organ kültürü veya in vivo çalışmalar ve doğrudan hedef doğrulama deneylerine ihtiyaç vardır.

1 Giriş

Dünya genelinde en sık görülen kongenital kraniofasial anomaliler dudak ve damak çatlağıdır (CLP) ve genelde sendromlu ve sendromsuz formlara ayrılabilir. CLP’nin etiyolojisi karmaşıktır ve özellikle sendromsuz vakalarda genetik yatkınlık ile çevresel faktörler arasındaki etkileşimler söz konusu olduğunda, sendromlu formlara kıyasla hâlâ iyi anlaşılmamıştır (Dixon ve ark., 2011). Epidemiyolojik çalışmalar, sendromsuz CLP’nin küresel görülme sıklığının yaklaşık 500’den 2.500 canlı doğumda birine kadar değiştiğini, bu oranların popülasyonlar ve coğrafi bölgeler arasında önemli farklılıklar gösterdiğini göstermektedir (Mossey ve Modell, 2012). Cinsiyet farkları da gözlemlenmekte olup dudak çatlağı erkeklerde, yalnızca damak çatlağı ise kadınlarda daha sık görülür (Mossey ve Modell, 2012). Ailesel kümelenme ve yinelenme çalışmalarının CLP için çok faktörlü eşik modelini desteklemesi (Grosen ve ark., 2010) ve genetik araştırmalardaki ilerlemelerin sayısız yatkınlık lokusunu ortaya koyması, ancak miraslılığın önemli bir kısmının hâlâ açıklanamaması (Mangold ve ark., 2011; Manolio ve ark., 2009; Khandelwal ve ark., 2013) dikkate alınmalıdır.

Dudak ve damak çatlağı cerrahi olarak düzeltilebilir olsa da, tarihsel olarak uzun vadeli sağlık sonuçları sınırlı olan durumlar olarak kabul edilmiştir. Ancak uzun vadeli takip çalışmalarının, CLP ile doğan bireylerin, başka kongenital anomalilerin olmamasına rağmen, bebeklikten yetişkinliğe uzanan artmış ölüm oranlarına sahip olduğunu gösterdiğini ortaya koymuştur (Christensen ve ark., 2004). Buna ek olarak, CLP yaşam kalitesinde bozulma ve sağlık hizmetleri kullanımında artış ile ilişkilidir; bu da etkilenen bireyler, aileler ve sağlık sistemleri üzerinde önemli bir ekonomik yük oluşturur (Wehby ve Cassell, 2010). Bu bulgular, CLP’nin altında yatan biyolojik mekanizmaları daha iyi anlamayı, böylece önleme, tedavi ve uzun vadeli sonuçları geliştirmeyi gerektirdiğini vurgulamaktadır.

MikroRNA’lar (miRNA), gen ifadesini esas olarak transkripsiyondan sonra, hedef mRNA’lar içinde tamamlayıcı dizilere bağlanarak düzenleyen küçük, kodlamayan RNA sınıfıdır (Lai, 2002). Sonraki çalışmalar, miRNA’ların korunmuş tohum dizileri aracılığıyla binlerce geni düzenlediğini ve gen ifadesi ağlarının ince ayarında merkezi bir rol oynadığını göstermiştir (Lewis ve ark., 2003). Çevirimsel baskılamanın ötesinde, miRNA’ların transkripsiyonel gen susturmasına, hücre döngüsüne bağlı çevirimsel kontrol ve DNA metillemesi dahil epigenetik düzenlemeye katıldıkları da gösterilmiştir (Kim ve ark., 2008; Vasudevan ve ark., 2008; Sinkkonen ve ark., 2008; Ørom ve ark., 2008). Bu çeşitli düzenleyici mekanizmalar sayesinde miRNA’lar gelişim ve hastalığın başlıca düzenleyicileri olarak öne çıkmış; kanser biyolojisinde, hücre metabolizmasında ve kök hücre korunmasında ve farklılaşmasında iyi belgelenmiş roller üstlenmiştir (Garofalo ve Croce, 2011; Chen ve ark., 2012; Kuppusamy ve ark., 2013; Garofalo ve ark., 2008; Ghafouri-Fard ve ark., 2020; Wallace ve O’Connell, 2017).

Çene damak oluşumu (palatogenez), kafatası sinir yatağı hücresi göçü, damak rafçıklarının dikey büyümesi, rafçık yükselmesi, yatay uzama ve nihayetinde temas ve füzyonla sonuçlanan son derece dinamik bir gelişimsel süreçtir (Ferguson, 1978). Bu olaylar, gen ifadesinin hassas uzaysal-zamansal kontrolünü gerektirdiğinden, miRNA aracılı düzenlemeye karşı özellikle duyarlıdırlar. Fare ağız-damak doku gelişimsel miRNA ifadesi profillemesi çalışmalarında, damak gelişiminin belirli aşamalarında belirli miRNA’ların işlev gördüğüne işaret eden ayrı zamanlı ifadesi desenleri ortaya konmuştur (Mukhopadhyay ve ark., 2010). Buna uygun biçimde, soy hat izleme ve kader haritalama çalışmalarının sinir yatağı kökenli mezankimya hücrelerinin damak yapılarına kritik katkı sağladığını göstermiş; böylece palatogenez sırasında miRNA aracılı düzenlemeye hücresel bir bağlam sağlanmıştır (Dougherty ve ark., 2012).

Diş çentik gelişiminde rol alan miRNA’lar arasında, miR-140’un nörokrest kökenli mezankimdeki trombosit türetilmiş büyüme faktörüne (PDGF) sinyal iletimini düzenleyerek diş çentik rafının büyümesini ve birleşmesini etkilediği gösterilmiştir (Eberhart ve ark., 2008). Üst düzey düzenleyici çalışmalar, Sox9’un kafatası-yüz gelişimi sırasında miR-140 ifadesini kontrol ettiğini ortaya koymuştur (Nakamura ve ark., 2012) ve genetik modeller miR-140’un normal kıkırdak gelişimi ve kafatası-yüz morfolojik oluşumu için gerekli olduğunu göstermiştir (Miyaki ve ark., 2010). Bu bulgular, PDGF sinyal iletiminin çeşitli nörokrest hücre popülasyonlarında temel bir rol oynadığını destekleyen daha geniş kanıtlarla uyumludur (Smith ve Tallquist, 2010). Sox9 ile ilişkili diş çentik oluşumunun düzenlenmesi ayrıca Wwp2 ve ara düzenleyici alt birim 25’i de içermektedir (Nakamura ve ark., 2011).

miR-140 dışında, miR-17–92 kümesi de diş çentik mezankim hücrelerinin çoğalması ve ekstraselüler matris sentezi için kritik bir düzenleyici olarak tanımlanmıştır. Fonksiyonel çalışmalar, miR-17–92’nin TGF-β sinyal iletim yolakının bileşenlerini hedef alarak bu süreçleri düzenlediğini göstermiştir ve bu kümenin bozulması diş çentik dahil olmak üzere kafatası-yüz anormalliklerine yol açmaktadır (Li ve ark., 2012). Ek genetik analiz, miR-17–92’nin AP-2α’nın doğrudan transkripsiyonel hedefi olduğunu ve ağız-yüz morfolojik oluşumunu düzenlemek için temel gelişimsel transkripsiyon faktörleriyle etkileşime girdiğini göstermiştir; bu da onun diş çentik gelişimindeki merkezi rolünü vurgulamaktadır (Wang ve ark., 2013).

miR-140 ve miR-17-92 kümesi, kraniofasial ve damak gelişiminde belirli işlevlere sahip olsa da, doku hücrelerinde işlevsel olarak değerlendirilen miRNA sayısı oldukça azdır. Küçük RNA dizileme taramamızda miR-124-3p, gelişmekte olan fare damak raflerinde aşama ile ilişkili ekspresyon değişiklikleri göstermiştir. Aynı dizileme veri seti burada özetlenmekte olup miR-124-3p seçimini temellendiren keşif temellerini belgelemek amacıyla sunulmaktadır; bağımsız bir doğrulama kohortu olarak sunulmamaktadır. Damak raf büyümesi mezankim hücrelerinin genişlemesine ve hayatta kalmasına bağlı olduğundan, kültür ortamında EPM hücrelerinde miR-124-3p aktivitesinin kazanılması veya kaybedilmesinden sonra öncelikli olarak çoğalma ve apoptozis gibi başlangıç hücre fenotiplerini değerlendirdik. Göç ve zenginleşmiş sinyal yolları deneysel olarak test edilmedi. Bu nedenle amaç, miR-124-3p’ın EPM hücre çoğalmasında ve apoptozisinde bir değişiklik yapılıp yapılmadığını belirlemek ve olası aşağı yörünge hedeflerini önermek, bunları kesin olarak ortaya koymak değil, idi.

2 Malzemeler ve yöntemler

2.1 Fare damak raflarının embriyonik doku örneklerinin toplanması ve küçük RNA dizilemesi

Spesifik patojen serbest ICR fareleri, kontrollü koşullarda (21-25 °C, %55 bağıl nem ve 12 saatlik aydınlık/karanlık döngüsü) Fujian Tıp Üniversitesi Laboratuvar Hayvan Merkezi’nde barındırıldı; yiyecek ve su serbestçe temin edildi. Zamanlanmış gebelikler, gece çiftleşmesi ile sağlandı ve vajinal tıkaçın tespit edildiği sabah embriyonik gün 0.5 (E0.5) olarak belirlendi. E13.5, E14.0, E14.5 ve E15.0 aşamalarındaki hamile fareler, boyun çıkartması yoluyla öldürüldü. Embriyolar, aseptik koşullar altında çıkarıldı, steril fosfat tamponlu tuz sulu çözeltisinde durulanıp kafaları kesildi. Dizileme için damak rafları toplanırken, yerinde hibridizasyon için embriyonik kafalar toplanıldı. Dizileme amacıyla her gelişimsel aşama üç RNA havuzu (toplamda 12 havuz) ile temsil edildi ve her havuz sekiz embriyondan 16 damak rafı içermektedir. Tüm hayvan prosedürleri Fujian Tıp Üniversitesi Birleşik Hastanesi Etik Kurulu tarafından incelenip onaylanmıştır.

2.2 Farklı İfade Edilen miRNA’ların Hedef Gen Tahmini ve Zenginleştirme Analizi

Materyal ve Yöntemler

1.3 Doku örnekleri

Embriyonik kafatası doku örnekleri, E13.5, E14.0, E14.5 ve E15.0 dönemlerinde farelerin başlarından parafin bloklarına yerleştirilerek kesildi. Bu kesitler, miR-124-3p sonucuna göre palatal mesenkimal hücrelerin çoğalması ve apoptozis üzerindeki etkisini değerlendirmek amacıyla kullanıldı.

1.4 Fareler

Deneyde, C57BL/6J kökenli embriyonik fareler kullanıldı. Fareler, standart laboratuvar koşullarında, 12 saatlik ışık-karanlık döngüsünde ve kontrollü ortamda beslendiler.

1.5 İstatistiksel analiz

Verilerin istatistiksel değerlendirmesi için SPSS 25.0 yazılımı kullanıldı. Veriler, ortalamaları ve standart sapmalarıyla ifade edildi. Gruplar arası karşılaştırmalar için tek yönlü varyans analizi (ANOVA) uygulandı ve post-hoc test olarak Tukey testi kullanıldı. p < 0,05 değeri istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.

2.1 Palatal mesenkimal hücre kültürü

Palatal mesenkimal hücreler (EPM), steril koşullarda, 37 °C sıcaklıkta ve %5 CO₂ içeren hücre kültürü ortamında, DMEM/F12 besleyici ortamda ve %10 embriyonik kökenli atalar hücre serumu (FBS) ile kültüre edildi. Hücreler, deney gerektirdiğinde, trypsin-EDTA ile detansiyon sağlandıktan sonra, yeni bir kültür plakasına aktarılıp çoğaltıldı.

2.2 Histolojik analiz

Embriyonik kafatasların parafin kesitleri, E13.5, E14.0, E14.5 ve E15.0 dönemlerinde farelerden alındı. Kesitler, hibritizasyon öncesinde deparafinize, yeniden hidrasyon geçirip ön işlemden geçirildi. miR-124-3p sonucuna göre hibritizasyon, SweAMI-DAB kromojenik yöntemiyle tespit edildi ve nükleer boyama hematoksilin ile yapıldı. Palatal raf içeren koronal kesitler, ışık mikroskobu ile incelenerek sinyalin bölgesel dağılımı değerlendirildi.

2.4 EPM hücre transfeksiyonu

Transfeksiyon günü, EPM hücreleri yaklaşık %60-80 konflüans seviyesine ulaşacak şekilde ekildi. miR-124-3p mimesi, miR-124-3p aktivitesini artırmak için tasarlanmış sentetik çift sarmallı RNA oligonükleotidi olarak tanımlandı; miR-124-3p inhibitörü ise, endojen miR-124-3p aktivitesini baskılamak için tasarlanmış sentetik antisans oligonükleotid olarak tanımlandı. Bunlar, ilgili negatif kontrolleri (MNC ve INC) ile birlikte kullanıldı. Transfeksiyon yapılmayan boş grup da dahil edildi.

Lizozom-oligonükleotid kompleksleri hazırlanıp, üretici talimatlarına göre hücrelere eklendi. Transfeksiyon ortamı, ardından taze kültür ortamıyla değiştirildi ve hücreler, RT-qPCR, çoğalma ve apoptozis testleri için belirtilen zaman noktalarında toplandı.

2.5 Transfeksiyondan sonra miR-124-3p ekspresyonunun RT-qPCR ile değerlendirilmesi

Beş deneysel grup analiz edildi: boş, miR-124-3p mimesi, MNC, miR-124-3p inhibitörü ve INC. Transfeksiyondan 48 saat sonra, toplam RNA toplandı ve miR-124-3p’in göreceli ekspresyonu RT-qPCR ile ölçüldü. Böylece mimesi ve inhibitörün ürettiği modülasyonun yönü ve büyüklüğü doğrulandı.

2.6 CCK-8 testi

EPM hücreleri, 96-delikli plakalara eklenip miR-124-3p mimesi, inhibitörü veya ilgili kontrollerle transfeke edildi. CCK-8 reaktifi, 0, 24, 48 ve 72 saatte eklendi ve 37 °C’de inkübasyondan sonra 450 nm’de absorbans ölçüldü. Absorbans değerleri, canlı hücre sayısı ve çoğalma aktivitesinin dolaylı bir ölçüsü olarak kullanıldı.

2.7 EdU inkorporasyon testi

Transfeksiyondan 48 saat sonra EPM hücreleri, DNA sentezini ölçmek amacıyla 2 saat boyunca EdU (5-etinil-2′-deoksiridizin) ile inkübe edildi, ardından üretici firmanın talimatlarına uygun şekilde sabitlendi, geçirgen hale getirildi ve boyandı. EdU birikimi floresan mikroskobu ile incelendi ve EdU pozitif hücrelerin yüzdesi nicelendirildi.

2.8 Hoescht boyama ve apoptozun akış sitometrisi ile analizi

Transfeksiyondan 72 saat sonra EPM hücreleri Hoescht boyası ile boyandı ve apoptotik morfoloji gösteren hücre çekirdekleri floresan mikroskobu ile nicelendirildi. Transfeksiyondan 48 saat sonra yapılan ayrı bir deneyde hücreler toplanıp yıkanıp, üretici firmanın talimatlarına uygun şekilde Annexin V-FITC ve propidyum iyodür ile boyandı. Erken ve geç apoptotik hücrelerin nicelendirilmesi akış sitometrisi kullanılarak gerçekleştirildi.

2.9 İstatistiksel analiz

Veriler, ortalaması ± standart sapma olarak ifade edildi ve SPSS 22.0 ile analiz edildi. Karşılaştırmalar bağımsız örneklem t-testi ile yapıldı ve p < 0,05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. Birden fazla karşılaştırma için düzeltme uygulanmadı. Grafikler GraphPad Prism 9 ile hazırlandı, ısı haritaları ve volkan grafiği ise R ile oluşturuldu.

3 Bulgular

3.1 Küçük RNA dizileme veri seti

3.1.1 Veri çıktısı istatistikleri

Son dizileme veri seti, E13.5, E14.0, E14.5 ve E15.0 gruplarının her biri için üçer havuzdan oluşan 12 havuzlu RNA örneğinden oluştu. Her havuzda sekiz fetustan elde edilen 16 damak rafı bulunuyordu. Yeterli RNA miktarına sahip olmayan (<1 µg) ilk ekstraktlar kütüphane oluşturma aşamasına girmeden atıldı; bu nedenle 12 son havuz kalite kontrol kriterlerini karşılayana kadar ek damak rafı malzemesi birleştirildi. Tüm son kütüphaneler 10^7 ham okuma değerinden fazlasını üretti ve Q30 değerleri %92’nin üzerindeydi (Eksik Tablo 1).

3.1.2 Veri kalite kontrolü ve uzunluk filtrelemesi

Ham veriler temiz okumalar elde etmek amacıyla filtrelenmiş, ardından 18–31 nükleotid uzunluğu aralığı dışındaki okular elenmiştir. Kalan yüksek kaliteli okular sonraki küçük RNA analizinde kullanılmıştır. Filtreleme sonuçları Eksik Tablo 2‘de özetlenmiştir. 12 örneğin arasında yüksek kaliteli okuların oranı, E13-5–1 örneğinde %50,02 ile en düşük, E14-5-2 örneğinde ise %93,28 ile en yüksek seviyede gerçekleşmiştir.

3.2 ncRNA sınıflandırılması

rRNA, snRNA, snoRNA ve tRNA’ya atanmış yüksek kaliteli okular elenmiş, kalan okular aday miRNA okuları olarak muhafaza edilmiştir. Aday miRNA’lar, dört gelişimsel grup için de okuların %30’dan fazlasını oluşturmuştur (Şekil 1). RNA sınıflarının aşamalar arasında genel olarak karşılaştırılabilir dağılımı, betimsel bir kalite kontrol özeti olarak kullanılmış ve gelişimsel bir etki kanıtı olarak yorumlanmamıştır.

3.3 Tekrarlı ve ekson/intron dizilerinin filtrelenmesi

Aday miRNA’lar, bilinen miRNA analizi için Bowtie yazılımı kullanılarak referans genomla hizalanmıştır. Ardından tekrarlı diziler, eksonlar ve intronlar elenmiştir. Kalan okular, miRDeep2 yazılımı kullanılarak yeni miRNA tahmin analizi için incelenmiştir. Tüm küçük RNA’lar, çeşitli ncRNA’lar, bilinen miRNA’lar, tekrarlı diziler, eksonlar, intronlar ve yeni tahmin edilen miRNA’lar için oku sayıları Eksik Tablo 3‘de özetlenmiştir.

3.4 miRNA farklılıkları analizi

En erken örneklenen aşamaya (E13.5) ve ardışık aşamalar arasındaki değişimleri betelemek amacıyla çift çift karşılaştırmalar seçildi. Değişken ifadesi gösteren miRNA’lar, |log2 katlama değişimi| > 1 ve nominal p < 0,05 kriterleriyle belirlendi; çünkü bu p değerleri çoklu test düzeltmesi yapılmadan hesaplandı, bu sayılar keşifsel nitelik taşır. E13.5’ine göre E14.0, E14.5 ve E15.0 grupları sırasıyla 33, 22 ve 55 adet yukarı regüle miRNA ile 46, 8 ve 28 adet aşağı regüle miRNA içermiştir (Eksik Tablolar 4–7). E14.0’a göre E14.5 ve E15.0 grupları sırasıyla 24 ve 79 adet yukarı regüle miRNA ile 10 ve 62 adet aşağı regüle miRNA içermiştir (Eksik Tablolar 8, 9). E14.5’e göre E15.0 grubu 20 adet yukarı regüle ve 18 adet aşağı regüle miRNA içermiştir (Eksik Tablo 10; Şekil 2).

Karşılaştırmalardaki miRNA ifadesi farklarının büyüklüğünü ve nominal önem derecesini göstermek amacıyla volkan grafiği oluşturuldu (Şekil 3). Kümeleme ısı haritaları, örnekler arasındaki ifade desenlerini göstermek için kullanıldı (Şekil 4), Venn diyagramları ise gruplar arasındaki ortak ve özgün miRNA’ları özetledi (Şekil 5).

3.5 Değişken miRNA hedef gen işlevsel zenginleştirme analizi

3.5.1 GO zenginleştirme analizi

Değişken ifadesi gösteren miRNA’ların tahmini hedeflerinin GO notasyonları, biyolojik süreç, moleküler fonksiyon ve hücre bileşeni alanları içinde özetlendi. Her karşılaştırma için her alandan en fazla 20 terim gösterildi (Şekil 6). E14.5-E13.5 karşılaştırması, E14.0-E13.5 ve E15.0-E13.5 karşılaştırmalarına göre belirgin biçimde farklı bir kategori dağılımı gösterdi. Analiz tahmini hedefler ve nominal p değerleri kullanıldığından, bu fark bir mekanizmanın kanıtı olarak değil, gelişimsel aşamaya özgü regülasyon için bir hipotez olarak değerlendirildi.

3.5.2 KEGG zenginleştirme analizi

Dışa dönük zenginleştirme analizi, farklı ifadesi değişen miRNA’ların tahmin edilen hedef genlerinde gerçekleştirildi. Her bir karşılaştırma için en üst 20 nominal olarak zenginleşen yol, balon grafikleri olarak gösterildi (Şekil 7). Bu bulgular, gelecekteki çalışmalar için aday yolların belirlenmesinde kullanıldı ve bir yolun aktive edildiği veya baskılandığına dair doğrudan bir kanıt olarak yorumlanmadı.

3.6 Gelişmekte olan damak dokularında miR-124-3p’nin yerinde konumlandırılması

Yerinde hibridizasyon için miR-124-3p, farklı ifadesi değişen miRNA’lar arasından seçildi. E13.5, E14.0, E14.5 ve E15.0 embriyonik başların koronal kesitlerinde, damak raf bölgesinde sinyal gözlemlendi (Şekil 8). Renkli reaksiyon testinin çözünürlüğüne göre, sinyal damak dokusunda yaygın bir şekilde dağılmış gibi göründü ve net biçimde tanımlanmış epitel veya mezankim hücre alt tipine sınırlı kalmadı. Damak dışında bulunan dokulardaki ifade sistematik olarak nicelendirilmedi.

3.7 Mimetik ve inhibitör grupları arasındaki miR-124-3p ifade düzeylerinin analizi

EPM hücreleri, miR-124-3p mimetiği, inhibitörü veya bunların karşılık gelen negatif kontrolleri (MNC ve INC) ile transfeke edildi; ayrıca transfeke edilmemiş boş bir grup da dahil edildi. 48 saat sonra, boş grup ile MNC grubu arasında miR-124-3p ifadesinde anlamlı bir fark yoktu (p > 0.05). Mimetik grupta ifade, MNC grubuna göre daha yüksekti ve inhibitör grupta ifade, INC grubuna göre daha düşüktü (her ikisi de p < 0.001; Şekil 9), oligonükleotid tedavilerinin hücre içi miR-124-3p düzeylerini beklenen yönlerde değiştirdiğini göstererek.

3.8 Transfekondan sonra EPM hücre çoğalması aktivitesini tespit etmek için CCK-8 testi

Transfeksiyon sonrası 0, 24, 48 ve 72 saatte CCK-8 absorpsiyonu ölçüldü (Şekil 10). 0 saatte gruplar arasında fark saptanmadı (p > 0,05). 24, 48 ve 72 saatte absorpsiyon, miR-124-3p mimesi grubunda MNC grubuna göre daha yüksekti (p < 0,001). İnhibitör grubunda absorpsiyon, 24 saatte INC grubundan daha düşüktü (p < 0,01) ve 48 ile 72 saatte daha düşüktü (p < 0,001). CCK-8 canlı hücre sayısının dolaylı bir ölçüsü olduğu için bu bulgular, miR-124-3p aşırı ifadesinden sonra artmış proliferatif aktiviteye ve inhibisyonundan sonra azalmış aktiviteye işaret eden tutarlı kanıtlar olarak yorumlandı.

3.9 Transfeksiyondan sonra EPM hücre proliferasyonunun EdU değerlendirmesi

EdU birikimi, transfeksiyon sonrası 48 saatte DNA sentezinin doğrudan bir ölçüsü olarak kullanıldı (Şekiller 11, 12). EdU pozitif hücrelerin yüzdesi, miR-124-3p mimesi grubunda MNC grubundan daha yüksekti (p < 0,01) ve inhibitör grubunda INC grubundan daha düşüktü (p < 0,05). Nicel sonuçlar dolayısıyla, miR-124-3p aktivitesi ile EPM hücre proliferasyonu arasında pozitif bir ilişki olduğunu destekledi.

3.10 Transfeksiyondan sonra EPM hücre apoptozunun Hoechst değerlendirmesi

Hoechst boyama, apoptotik çekirdek morfolojisinin değerlendirilmesi için transfeksiyon sonrası 72 saatte kullanıldı (Şekiller 13, 14). Hoechst pozitif hücrelerin yüzdesi, miR-124-3p mimesi grubunda MNC grubundan daha düşüktü (p < 0,05) ve inhibitör grubunda INC grubundan daha yüksekti (p < 0,01). Bu veriler, miR-124-3p aktivitesinin artırılmasıyla apoptozun azaldığını ve inhibisyonu artırılmasıyla apoptozun arttığını destekledi.

3.11 Transfeksiyondan sonra EPM hücre apoptozunun akış sitometrisi değerlendirmesi

Akış sitometrisi, apoptozun transfeksiyon sonrası 48 saatte nicelendirilmesi için kullanıldı (Şekiller 15, 16). Apoptoz oranı, miR-124-3p mimesi grubunda boş ve MNC gruplarına göre daha düşüktü ve inhibitör grubunda boş ve INC gruplarına göre daha yüksekti (hepsi p < 0,001). Bu bulgular, Hoechst boyama sonuçlarının yönünü bağımsız olarak destekledi.

4 Tartışma

İkincil damak oluşumu, maksiller çıkıntılardan eşleşmiş damak rafının koordineli şekilde uzamasını, dilin üzerinde yükselmesini, orta çizgide temasını ve birleşmesini gerektirir. Sıçanlarda, dikey raflardan yükselmiş yatay raflara geçiş E14.0-E14.5 dönemlerinde hızlı bir şekilde gerçekleşir ve anterior-posterior ekseni boyunca değişkenlik gösterir (Ferguson, 1978; Yu ve Ornitz, 2011). Bu hızlı morfolojik geçiş, E14.5 ile E13.5 karşılaştırmasında gözlemlenen farklı GO kategorisi dağılımı için olası bir gelişimsel bağlam sunmaktadır. Buna rağmen, zenginleştirme analizi tahmini hedeflere ve nominal p değerlerine dayanıldığından, gözlemlenen desen keşfedici nitelikte olarak değerlendirilmelidir.

Bu çalışma, damak gelişimiyle ilişkilendirilen miRNA kataloğunu, miR–124-3p’yi kültüre edilmiş EPM hücrelerindeki hücre fenotipleriyle bağlayarak genişletmektedir. Bu katkı, damatogenez sırasında Pdgf’ye bağlı kafatası sinir yosunu davranışının düzenlenmesini gösteren miR-140 üzerine yapılan önceki çalışmalar (Eberhart vd., 2008) ve miR-17-92 kümesinin, sıçan damak mezankim hücrelerinde TGF-β yolak bileşenlerini, çoğalmayı ve kolajen sentezini modüle ettiğini gösteren çalışmalar (Li vd., 2012) ile ayrı bir konumda yer almaktadır. Verilerimiz ise miR-124-3p’yi çoğalma ile apoptoz arasındaki dengeyle ilişkilendirmektedir.

Çoğalma ve apoptoz, raf büyümesinin önkoşulu olan damak mezankiminin yeterli genişlemesinin ve hayatta kalmasının seçilmesi nedeniyle ele alınmıştır. CCK-8 ve EdU sonuçları yön olarak uyumluydu ve apoptoz için Hoescht boyama ile akış sitometrisi tamamlayıcı kanıt sağladı. Bu testler bir hücre fenotipini destekler ancak miR-124-3p’nin embriyoda raf yükselmesini veya birleşmeyi kontrol ettiğini kendileri kanıtlamaz. EPM modeli damak epitelinden ziyade damak mezankim hücrelerini temsil etmektedir.

Hedef gen zenginleştirme, Wnt, MAPK ve Hippo ile ilişkili birkaç gelişimsel sinyal yolaklarını öne çıkardı. Bu çalışmada yolak aktivitesi, hücre göçü, ekstraselüler matriks üretimi veya farklılaşma test edilmedi. Proliferasyon ve apoptoz, kontrollü miR-124-3p kazancı ve işlev kaybından sonra bağımsız testlerle değerlendirilebileceği için ilk işlevsel değerlendirme olarak önceliklendirildi. Dolayısıyla zenginleştirme sonuçları, doğrulanmış aşağıyönlü mekanizmalar değil, sonraki mekanistik çalışmalar için hipotezler sunmaktadır.

miR-124-3p seviyelerinin artırılması CCK-8 emilimini ve EdU katkısını artırdı, apoptoz ölçümlerini azalttı; miR-124-3p inhibisyonu ise tersine değişimler üretti. Bu testler arasındaki uyum, miR-124-3p aktivitesi ile EPM hücre proliferasyon-yaşam dengesi arasındaki ilişkiyi desteklemektedir. Sentetik mimes ve inhibitörler, endojen miRNA işleme ve dozajından farklı etkiler üretebileceğinden, bulgular tam bir fizyolojik miR-124-3p işlev modeli olarak değil, bozma kanıtı olarak yorumlanmalıdır. Önceki çalışmalar, miR-124’ü nörolojik bozukluklarda (Angelopoulou vd., 2019; Bahlakeh vd., 2021; Han vd., 2020) ve kanserde (Jia vd., 2019) incelemiştir. Kansere ilişkin bulgular arasında, meme kanserinde miR-124a genlerinin metilasyonu (Ben Gacem vd., 2014), mide kanserinde miR-124-3p ile ilişkili kodlanmayan RNA ağları (Huang vd., 2020; Liu vd., 2019; Sun vd., 2020) ve hepatosellüler karsinomda Slug, PIM-1 ve ANXA7’yi içeren etkileşimler yer almaktadır (Cui vd., 2019; Qi vd., 2020; Wang vd., 2020). Bu hastalık bağlamı gözlemleri arka plan sunmakla birlikte, damak mezankimal hücrelerinde bir mekanizmayı kanıtlamaz.

Bu Araştırmanın Sonuçları: miR-124-3p, Damak Mezankim Hücrelerinde Çoğalmayı Artırır ve Apoptozu Baskılar

Biyobilişimsel tahmin, Prrx1’i miR-124-3p’nin aday hedefi olarak belirlemiştir. Prrx1 biyolojik açıdan olası bir adaydır; çünkü eşli-ilişkili homeobox geni mezankim kökenli doku hatlarında ifade edilir ve Prrx1/MHox işlev kaybı fare modellerinde çatlak damak dahil olmak üzere ciddi kraniofasial iskelet anomalileri gözlenmiştir (Martin ve ark., 1995). Ancak bu makalede sunulan veriler, Prrx1 3′-UTR rapor deneyi, miR-124-3p müdahalesinden sonra Prrx1 RNA veya protein düzeylerinin ölçülmesi veya kurtarma (rescue) deneyi içermemektedir. Dolayısıyla Prrx1, kanıtlanmış doğrudan bir hedef olmaktan ziyade tahmini bir aday olarak kalmaya devam etmektedir.

Değerlendirilmesi gereken birkaç kısıtlama da bulunmaktadır. Tüm fonksiyonel deneyler, damak rafı organ kültürü, primer fare damak hücre kontrolleri veya in vivo kazanım/kaybı işlev analizi olmadan kültür edilmiş EPM hücrelerinde gerçekleştirilmiştir. Renkli in situ deneyi hücre tipine özgü ekspresyonu ayırt edememiştir ve damaktan dışındaki dokular sistematik olarak değerlendirilmemiştir. Hücre göçü ve zenginleşmiş sinyal iletim yolları test edilmemiştir. Ayrıca dizileme ve zenginleştirme analizleri, çoklu test düzeltmesi uygulanmadan nominal p-değer eşik değerleri kullanılmıştır. Bu kısıtlamalar, sonuçların yalnızca in vitro bir ilişki düzeyinde kalmasını ve gelecekteki doğrulama çalışmalarının önceliklerini belirlemesini gerektirmektedir.

5. Sonuç

Kültür edilmiş EPM hücrelerinde miR-124-3p düzeylerindeki deneysel değişiklik, çoğalma ve apoptozda karşılıklı değişimler ile ilişkilendirilmiştir. Bu bulgular, miR-124-3p’yi damak mezankim hücre davranışının aday düzenleyicisi olarak ortaya koymaktadır; ancak embriyonik damak oluşumu (palatogenez) dönemindeki rolü ve Prrx1 dahil tahmini hedefleri, damak dokularında doğrudan doğrulama gerektirmektedir.

Beyanlar

Veri erişilebilirliği beyanı

Çalışmada sunulan özgün katkıların tamamı makalede/Eksiksiz Materyal bölümünde yer almaktadır. Ek sorular için ilgili yazar ile iletişime geçilebilir.

Etik beyan

Fujian Tıp Üniversitesi Birleşik Hastanesi Etik Kurulu hayvan çalışmalarını onayladı. Çalışmalar, yerel mevzuata ve kurumsal gerekliliklere uygun şekilde yürütüldü. Araştırmaya katılan hayvanların sahiplerinden yazılı bilgilendirilmiş onay alındı.

Yazar katkıları

ML: Kavramsallaştırma, yazı – ilk taslak. FL: Araştırma, yazı – ilk taslak. WC: Yazı – ilk taslak. YuL: Yazı – ilk taslak, yazılım. YoL: Veri yönetimi, yazı – değerlendirme ve düzenleme. CM: Yazı – değerlendirme ve düzenleme. WZ: Yazı – değerlendirme ve düzenleme, denetim.

Çakışma konusu

Yazarlar, bu çalışmanın potansiyel bir çakışma konusu olarak değerlendirilebilecek ticari veya mali ilişkilerin bulunmadığı koşullarda yürütüldüğünü beyan ettiler.

Üretici yapay zekâ beyanı

Yazarlar, bu makalenin oluşturulmasında üretici yapay zekânın kullanılmadığını beyan ettiler.

Bu makalede figürlerle birlikte verilen her türlü alternatif metnin (alt metin) Frontiers tarafından yapay zekâ desteğiyle oluşturulmuş olup doğruluğu sağlamak için makul çabalar gösterilmiştir; mümkün olduğunda yazarların da değerlendirmesi sağlanmıştır. Herhangi bir sorun tespit ederseniz lütfen bizimle iletişime geçin.

Yayıncının notu

Bu makalede ifade edilen tüm iddialar yalnızca yazarlara aittir ve gerek kuruluşlarına, gerek yayıncıya, editörlere ve değerlendiricilere aittir. Bu makalede değerlendirilebilecek her türlü ürün veya üreticisinin yapabileceği her türlü iddia, yayıncı tarafından garanti edilmez veya desteklenmez.

Ek materyal

Bu makalenin ek materyali şu adreste çevrimiçi olarak bulunabilir: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fphys.2026.1934368/full#supplementary-material

Kısaltmalar

CLP, dudak ve damak çatlağı; miRNA, mikroRNA; EPM, embriyonik damak mezankimal; RT-qPCR, ters transkripsiyon nicel polimeraz zincir reaksiyonu; CCK-8, Hücre Sayım Kiti-8; EdU, 5-etinil-2′-deoksüridin; GO, Gen Ontolojisi; KEGG, Gen ve Genomlar Kyoto Ansiklopedisi.

Özet

Anahtar kelimeler

apoptoz, hücre çoğalması, damak çatlağı, embriyonik damak mezankimal hücreleri, MiR-124-3p, damak raf büyümesi, küçük RNA dizilimi

Atıf

Lu M, Lu F, Zhou W, Lin Y, Lai Y, Mao C ve Chen W (2026) Kültürde yetiştirilen damak mezankimal hücrelerinde MiR-124-3p çoğalmayı teşvik eder ve apoptozi baskılar. Front. Physiol. 17:1934368. doi: 10.3389/fphys.2026.1934368

Alınma

10 Temmuz 2026

Düzeltme

02 Ekim 2026

Kabul

19 Ekim 2026

Yayın

13 Kasım 2026

Cilt

17 – 2026

Marianna Bei, Harvard Tıp Fakültesi, Amerika Birleşik Devletleri

Shu Lou, Nanjing Tıp Üniversitesi, Çin

Emily Yu, Philadelphia Çocuk Hastanesi Araştırma Enstitüsü, Amerika Birleşik Devletleri

© 2026 Lu, Lu, Zhou, Lin, Lai, Mao ve Chen.

Bu açık erişimli makale, Yaratıcı Ortaklıklar Lisansı (CC BY) koşulları altında dağıtılmaktadır. Başka forumlarda kullanım, dağıtım veya çoğaltma, orijinal yazarların ve telif hakkı sahiplerinin belirtilmesi ile bu dergideki orijinal yayının alıntılanması koşuluyla, kabul edilen akademik uygulamalara uygun olarak izne tabidir. Bu koşullara uymayan hiçbir kullanım, dağıtım veya çoğaltma izne tabidir.

*İletişim: Weihui Chen, lufengfjmu@163.com; Chuanqing Mao, 344083604@fjmu.edu.cn; Yongzhen Lai, 277627851@qq.com

†Bu yazarlar bu çalışmaya eşit katkıda bulunmuş ve birinci yazarlık payını paylaşmaktadır

Bu makalede ifade edilen tüm iddialar yalnızca yazarların kendi görüşlerini yansıtmakta olup, bağlı oldukları kuruluşların, yayıncının, editörlerin ve değerlendiricilerin görüşlerini yansıtmayabilir. Bu makalede değerlendirilebilecek herhangi bir ürün veya üreticisinin yapabileceği herhangi bir iddia, yayıncı tarafından garanti edilmez veya onaylanmaz.